웨스턴 블랏(Western blot)은 원하는 단백질의 발현 여부와 양을 확인하는 방법입니다. 간단히 설명하자면, 먼저 세포나 조직에서 단백질을 추출합니다. 그 후에 단백질을 정량하고, 적당량을 젤에 로딩합니다. 젤을 바로 쿠마씨 염색(Coomassie Brilliant Blue) 혹은 실버 스테인 염색을 통해 단백질 패턴을 확인하거나, 젤에 있는 단백질을 트랜스퍼를 통해 멤브레인으로 옮긴 후, 타깃 단백질의 안티바디를 추가하면 원하는 단백질의 발현 여부와 양을 확인할 수 있습니다.
단백질 추출
실험실에서 가장 일반적으로 사용하는 웨스턴 블랏은 배양 세포에서 단백질을 추출하여 검사하는 방법입니다. 먼저 플레이트의 미디어를 버리고 1X PBS (Phosphate-buffered saline)로 두 번 씻은 후, 스크레퍼 (Cell scraper)를 사용하여 세포를 긁어내어 1.5 ml 튜브(Tube)로 옮깁니다. 원심분리기 (Centrifuge)를 이용하여 튜브에서 남은 PBS를 제거한 후, 셀 펠릿 (pellet)의 5~7배의 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 추가하고 30분 동안 얼음에 둡니다. 30분 후 4°C에서 13,000 rpm으로 원심분리를 10분 동안 진행한 다음, 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브에 담습니다. 실험에 따라 전체 세포에서 단백질을 추출하기 위해 소닉에이션을 사용하기도 합니다. 조직에서 단백질을 추출하는 경우에는, 얼린 조직을 홈오게나이저를 이용하여 잘게 부수고, 그 조직에 라이시스 버퍼를 추가하여 단백질을 추출합니다.
단백질 정량
추출한 단백질을 정량하기 위해 실험실에 있는 도구를 사용하면 됩니다. 예를 들어, DC Protein Assay Kit [Bio-Rad]를 사용하여 추출한 단백질을 96 웰에 샘플당 2개 또는 3개 측정하고, 그 평균값을 구한 다음 스탠더드와 비교하여 단백질량을 측정합니다. 시약을 넣을 때 거품이 생기지 않도록 주의하고, 거품이 생긴 경우 주사기 바늘로 터뜨려야 합니다. 단백질 정량이 끝나면 추출한 단백질의 일부를 4X sample buffer (Tris-HCl pH6.8, SDS, 2-ME, glycerol, bromophenol blue)와 섞어서 -81°C에서 끓이지 않고 보관합니다.
웨스턴 블랏
실험 당일, sample buffer와 섞인 단백질을 5분간 끓인 후 원심분리기로 분리합니다. 그다음 적당량 (30μg)을 젤(gel)에 로딩합니다. 이때, 사이즈 마커(size marker)를 첫 번째와 마지막 웰에 로딩합니다. 예를 들어, 첫 번째 웰에 4μl의 사이즈 마커를 로딩하면 마지막 웰에는 2μl를 로딩합니다. 이는 트랜스퍼(transfer) 시 단백질 로딩 순서와 방향을 확인하기 위함입니다. 또한, 양쪽의 사이즈 마커를 이용해 트랜스퍼 후 멤브레인(membrane)을 타깃 단백질 사이즈 별로 잘라낼 수 있습니다. 예를 들어, 타깃 단백질의 molecular weight가 200과 50인 경우, 사이즈 마커를 이용해 각각 잘라내고 각각의 안티바디를 처리합니다. 젤 러닝이 끝나면 젤을 멤브레인으로 트랜스퍼합니다. 전체 단백질 패턴을 확인하려면 트랜스퍼하지 않고, 젤에 쿠마씨 염색이나 실버 스테인을 통해 단백질 패턴을 확인합니다. 멤브레인으로 트랜스퍼하는 동안 5% blocking 버퍼를 준비합니다.
젤을 실행한 후에는 젤을 멤브레인으로 전송하고, 5% blocking 버퍼를 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 멤브레인은 타깃 크기로 양쪽 단백질 마커를 사용하여 자릅니다. 1% blocking 버퍼에 1차 항체를 넣고 4°C에서 밤새 보관합니다. 다음 날, 워싱 버퍼로 5분간 3번 워싱을 한 후, 1% blocking 버퍼에 2차 항체를 넣고 실온에서 1시간 동안 처리합니다. 멤브레인 워싱 후에는 적절한 시약으로 멤브레인을 5분간 처리합니다. 웨스턴 블랏 신호가 약할 경우, 강도가 높은 시약으로 다시 처리합니다. 웨스턴 블랏 신호를 확인할 때는 ChemiDoc 또는 암실에서 X-레이 필름을 사용합니다.
안티바디 (Antibody) 고르기와 안티바디 농도 결정
웨스턴 블랏을 위한 안티바디 선택 방법에 대해 알아보겠습니다. 먼저, 실험에 필요한 안티바디를 사용한 이미 발표된 논문을 찾아 리스트를 작성합니다. 예를 들어, 웨스턴 블랏을 위해 어떤 샘플(조직, 배양 세포)을 사용하였는지, 단백질 추출량은 얼마나 되는지, 안티바디를 판매하는 회사와 안티바디의 양, 가격, 그리고 어떤 이차 안티바디를 사용하는지를 찾아 리스트를 작성합니다. 이때, 찾고자 하는 안티바디가 여러 논문에서 사용되었는지도 확인합니다.
안티바디를 구매한 후에는 안티바디 구성요소에 글리세롤이 포함되어 있지 않다면, 100% 글리세롤을 1:1 비율로 추가하여 보관합니다. 이렇게 하면 최종 농도는 글리세롤 50%가 되어 안티바디가 얼었다가 녹을 때 발생하는 손상을 방지하여 안티바디를 잘 보관할 수 있습니다.
안티바디가 도착하면, 웨스턴 블랏에서 사용할 안티바디 농도를 결정해야 합니다. 기존에 실험실에서 자주 사용한 안티바디라면, 준비된 조건으로 실험을 진행하면 됩니다. 그러나 새로운 안티바디를 사용할 경우, 번거롭더라도 실험을 통해 사용할 안티바디 조건을 정해야 합니다. 관련된 논문이 있다면, 논문을 기준으로 여러 농도를 테스트합니다.
안티바디 조건을 설정하기 위한 다양한 방법이 있겠지만, 세포에서 추출한 단백질 10 µg을 젤에 마커와 함께 로딩합니다. 로딩한 다음 젤을 실행하고, 젤을 멤브레인에 전송한 다음, 마커와 단백질을 로딩한 웰을 한 묶음으로 자릅니다. 테스트할 새로운 안티바디를 여러 농도(1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000)로 테스트합니다. 테스트한 결과 중 가장 좋은 조건을 사용합니다.
